Mca-APK（Dnp）ACE2熒光底物

簡要概述

ACE2（血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2）是一種金屬蛋白酶，需要將二價(jià)陽離子置于活性位點(diǎn)才能進(jìn)行催化。ACE2 近被確定為SARS-CoV-2受體，在免疫，炎癥，ACE2和心血管疾病之間提供了關(guān)鍵的聯(lián)系。盡管與SARS-CoV具有密切的進(jìn)化關(guān)系，但SARS-CoV-2的受體結(jié)合域在幾個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基上有所不同，從而與人ACE2受體具有更強(qiáng)的結(jié)合親和力，這可能是SARS-CoV-2致病性更大的原因。由SARS-CoV-2結(jié)合后，ACE2功能的喪失是由內(nèi)吞作用以及蛋白水解切割和加工的激活驅(qū)動(dòng)的。ACE2系統(tǒng)是防止心力衰竭（包括心肌梗塞和高血壓）以及肺部疾病和糖尿病的重要保護(hù)途徑。ACE2控制腸營養(yǎng)不良和血管通透性已成為肺動(dòng)脈高壓和糖尿病性心血管并發(fā)癥的重要機(jī)制。Mca-APK（Dnp）ACE2底物是一種FRET肽，用于測(cè)量細(xì)胞和組織中的酶活性。它使用DNP作為淬滅劑分子來淬滅甲氧基香豆素（Mca）的熒光。當(dāng)酶切割脯氨酸-賴氨酸殘基并恢復(fù)Mca的熒光時(shí)，這種相互作用被消除。這種熒光底物比常用的基于HPLC分離的方法具有更大的靈活性和更高的通量。

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產(chǎn)品說明書

樣品分析方案

簡要概述

準(zhǔn)備測(cè)試樣品和空白樣品（50 μL）

根據(jù)需要用抑制劑處理樣品

加入Mca-APK（Dnp）ACE2底物工作溶液（50 μL）

在37°C下孵育樣品

在Ex / Em = 320/430 nm（截止= 420 nm）下檢測(cè)熒光

儲(chǔ)備溶液配制

Mca-APK（Dnp）ACE2底物原液
用適量的DMSO準(zhǔn)備5-10 mM的儲(chǔ)備溶液。
注意：將溶液分裝后在-20°C下，避光保存。

工作溶液配制
Mca-APK（Dnp）ACE2底物工作溶液
在1 mL分析緩沖液中加入5 μL Mca-APK（Dnp）ACE2底物儲(chǔ)備液（10 mM），制成Mca-APK（Dnp）ACE2底物工作液。
注意：應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)測(cè)量底物的適當(dāng)濃度。
注意： 終濃度為50 μM。
注意：100 mM含1 M NaCl，pH約7.5的Tris-HCl可用作檢測(cè)緩沖液。也可以將600 μM的ZnCl₂添加到緩沖液中。

操作步驟

以下方案可用作參考。

1. 準(zhǔn)備并添加50 μL測(cè)試樣品和空白對(duì)照。

2. 向樣品和空白樣品中加入50 μL Mca-APK（Dnp）ACE2底物工作溶液。

3. 在37°C下孵育樣品。

4. 用熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 320/430 nm（截止= 420 nm）下檢測(cè)熒光增加。

對(duì)于動(dòng)力學(xué)讀數(shù)：立即開始連續(xù)不斷地測(cè)量熒光強(qiáng)度，并每5分鐘記錄一次數(shù)據(jù)，持續(xù)30-120分鐘。
對(duì)于終點(diǎn)讀數(shù)：在避光的條件下，將反應(yīng)在所需溫度下孵育30至120分鐘。然后檢測(cè)熒光強(qiáng)度